蛋白PAGE凝膠快速制備試劑盒（紅色上層膠）
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貨號
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說明
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規(guī)格
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RTD6133
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蛋白PAGE凝膠快速制備試劑盒（紅色上層膠）
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45-90板膠
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Protein PAGE Gel Fast Preparation Kit （Red Stacking Gel）
● 貨品內(nèi)容：
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組份
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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保存
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1
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AC2914-01
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40%PAA（29：1）
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100 ml
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4℃
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2
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RTD6133-UA
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紅色上層膠溶液A（2×）
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50 ml
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4℃
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3
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RTD6133-LB
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下層膠溶液B（2×）
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180 ml
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4℃
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4
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RTD6133-SP
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改良型促凝劑
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8 ml
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4℃，配制后-20℃貯存
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5
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1018210CM
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1.0 mm玻璃板/梳子套裝
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2套
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RT
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6
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說明書
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-
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● 產(chǎn)品簡介：
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，采用合理設計的預混合配方和配制流程，可在30-50分鐘內(nèi)配制得到高質(zhì)量的聚丙烯酰胺凝膠，用于變性和非變性蛋白凝膠電泳。本產(chǎn)品可以配制常用下層膠濃度6%、8%、10%、12%和15%，可以滿足絕大多數(shù)蛋白電泳需求。
本試劑盒可配制45-90塊常規(guī)大小（8×10cm）的PAGE膠，具體凝膠數(shù)量和凝膠濃度、厚度以及凝膠的大小有關。按照10%凝膠，大小8×10cm，可以配置0.75 mm厚度凝膠約90板，1.0 mm厚度凝膠約68板，1.5 mm厚度凝膠約45板。
● 運輸和貯存：
本產(chǎn)品常溫運輸；組份按照標簽溫度貯存；有效期一年。
● 特點：
1. 方便：紅色上層膠，方便上樣；
2. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨添加TEMED；
3. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電泳（Native-PAGE）；
4. 配備1.0 mm厚度玻璃板和電泳梳子，方便實驗。
● 使用說明：
一 凝膠制備：
1.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2 根據(jù)下表參考選擇合適的凝膠濃度：
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下層膠（下層膠）濃度
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最佳分離范圍
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6%
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50-350 kD
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8%
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35-300 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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1.3配制一塊常用凝膠(10×8 cm)所需下層膠和上層膠體積(下層膠按6厘米高度計算，上層膠按1.5厘米高度計算，均含約0.2 ml的冗余量)參見下表。
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凝膠厚度
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下層膠體積
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上層膠體積
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0.75 mm
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4.0 ml
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1.0 ml
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1.0 mm
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5.0 ml
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1.5 ml
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1.5 mm
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8.0 ml
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2.0 ml
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注：下層膠體積已包含適量冗余，請勿全部用于灌制下層膠，以免灌膠時上層膠高度不夠。
1.4配制下層膠：
參考下表，配制不同濃度的下層膠。適當混勻后倒入到制膠模具中，用蒸餾水或異丙醇或無水乙醇封住液面，直至下層膠凝固充分后再進行PAGE上層膠的配制。通常25℃ 10-40分鐘內(nèi)下層膠會凝固。注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。上層膠25℃ 10-15分鐘可以聚合凝固；18℃ 35-40分鐘可以聚合凝固。
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組份
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不同凝膠體積對應各組份的取樣量（ml）
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6％ 膠
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5
ml
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10
ml
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15
ml
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20
ml
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H2O
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1.7
|
3.4
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5.1
|
6.8
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下層膠溶液B（2×）
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2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
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40％ PAA（29:1）
|
0.75
|
1.5
|
2.25
|
3.0
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改良型促凝劑
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0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
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8％ 膠
|
5 ml
|
10 ml
|
15 ml
|
20 ml
|
|
H2O
|
1.45
|
2.9
|
4.35
|
5.8
|
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下層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
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10％ 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
|
1.2
|
2.4
|
3.6
|
4.8
|
|
下層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.25
|
2.5
|
3.75
|
5.0
|
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.1
|
0.2
|
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12％ 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
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H2O
|
0.95
|
1.9
|
2.85
|
3.8
|
|
下層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.5
|
3.0
|
4.5
|
6.0
|
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
|
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15％ 膠
|
5
ml
|
10
ml
|
15
ml
|
20
ml
|
|
H2O
|
0.575
|
1.15
|
1.725
|
2.3
|
|
下層膠溶液B（2×）
|
2.5
|
5.0
|
7.5
|
10.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
1.875
|
3.75
|
5.625
|
7.5
|
|
改良型促凝劑
|
0.05
|
0.1
|
0.15
|
0.2
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1.5配制上層膠：
按照如下表格配制4% PAGE上層膠。下層膠灌注后，去除壓膠溶液，配制好的上層膠緊貼玻璃板均勻輕柔注入到下層膠上，小心插入梳子等待凝固。
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組份
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不同凝膠體積對應各組份的取樣量（ml）
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4％上層膠（上層膠）
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2
ml
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4
ml
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6
ml
|
8
ml
|
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H2O
|
0.78
|
1.56
|
2.34
|
3.12
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紅色上層膠溶液A（2×）
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1.0
|
2.0
|
3.0
|
4.0
|
|
40％ PAA（29:1）
|
0.2
|
0.4
|
0.6
|
0.8
|
|
改良型促凝劑
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0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
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注：紅色上層膠緩沖液(2×)使用前須搖勻。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合凝固；18℃ 35-40分鐘可以聚合凝固。
二 電泳：
2.1 SDS-PAGE變性電泳：
2.1.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上樣
5×蛋白上樣緩沖液（變性，還原）常溫數(shù)分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl
5×上樣緩沖液；將蛋白樣品置于95℃中加熱5-10分鐘；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。
2.1.3 電泳過程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
SDS-PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流（一板膠）
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結(jié)束電流（一板膠）
|
電泳時間
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適用條件
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|
150V
|
35-40
mA
|
15-20
mA
|
55
+ min
|
最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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200V
|
45-55
mA
|
20-25
mA
|
45+
min
|
節(jié)省時間
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225V
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40-50
mA
|
15-20
mA
|
35+
min
|
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250V
|
65-75
mA
|
20-25
mA
|
30+
min
|
|
300V
|
70-80
mA
|
25-35mA
|
25+
min
|
最省時間
|
2.2 非變性電泳（Native PAGE）：
2.2.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理：融化-混合-上樣
5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液常溫數(shù)分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl
5×上樣緩沖液；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。注：非變性電泳樣品不能加熱處理。
2.2.3 電泳過程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
Native PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時間
|
適用條件
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推薦電壓
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150V
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25-35/板膠
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5-10 mA/板膠
|
60 + min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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三. 染色：
1. 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規(guī)考馬斯亮藍染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
2. 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可見。
3. 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
4. 觀察保存結(jié)果。